Chaîne d'HPLC (instrumentation)

Les différentes parties d'une chaîne d'HPLC

Une chaîne d’HPLC est constituée :
- des solvants (phase mobile) de grade HPLC. Une pureté inférieure est possible mais nuit à la qualité de l'élution et risque de détériorer prématurément la colonne. L’échantillon à injecté est préparé dans un solvant identique à la phase mobile. La concentration est de l’ordre de 100mg à 1g/L)
- d’un système de dégazage : les gaz dissous ( O2, N2…) ont une influence sur la compressibilité du solvant. Un barbotage à l’hélium permet de les éliminer. Cependant, certains solvants sont vendus dégazer prêts à l'emploi.
- d’une pompe : ce sont des pompes délivrant un débit stable et non pulsé ( généralement 2 pistons fonctionnant en décalé). La qualité de la pompe est importante car elle permet d'avoir une ligne de base parfaitement rectiligne. Elles doivent permettre notamment d’avoir un débit précis et constant, de fournir du solvant sans coupure dans le temps et de pouvoir changer de solvant facilement.
- d’un injecteur : ce sont généralement des injecteurs en boucle qui permettent d'injecter avec précision toujours le même volume de liquide dans la chaîne d'HPLC. Son volume varie généralement de 5 à 20 µL).
Le volume d'injection doit être inférieur au 1/100 du volume mort (VM) qui représente environ 60% du volume de la colonne vide. Pour une colonne d'ID=4,6 mm et de longueur 150 mm, VM= 0,65xπ(2,3)²x150 = 1.5 mL. D'où un volume d'injection inférieur à 15µL.


Mode d'emploi de l'injecteur
Etape 1 : on rempli la boucle avec la seringue.

Injecteur à boucle d'une chaîne d'HPLC

Etape 2 : le produit dans la boucle est injectée.

Injection du produit dans la colonne d'HPLC


- d’une colonne : c'est le coeur de la séparation. Il est donc important de la choisir en fonction des substances à séparer et de prendre toutes les précautions nécessaires à son utilisation. . Elles se présentent sous la forme d’un tube en acier inoxydable résistant à des pressions de plus de 400 bars.
- d’un détecteur: Le plus courant est basé sur la loi de beer-lambert. Il mesure l’absorbance de la substance à une longueur d’onde donnée. Les détecteurs à barrette de diode également basés sur la mesure de l'absorbance permettent d'obtenir un chromatogramme pour plusieurs longueurs d'onde.

Autres types de détecteur:
- détecteur à spectrométrie de masse
- détecteur à  fluorescence
- détecteurs à  indice de réfraction