Fluorimétrie

La fluorimétrie est une méthode de dosage utilisant la propriété de certaines molécules d'être fluorescente. On mesure la fluorescence qui est proportionnelle à la concentration.

Intensité de la fluorescence en fluorimétrie

Rendement quantique de fluorescence
On définit le rendement quantique de fluorescence comme étant le rapport de l’intensité de fluorescence émise sur l’intensité absorbée. 
Soit :
Φf :  le rendement quantique de fluorescence
If : l’intensité de fluorescence
Ia : intensité absorbée
I0 : l’intensité incidente
I : l’intensité transmise

Φf = If/Ia = If/(I0-I) = If.I0.(1-I/I0)
L’absorbance A = - log T = - log I/I0

D’où : Φf = If.I0.(1- 10-A)
Sachant que 10-A = 1 – 2.303A + (2.303A)²/2 ! -….
En approximant 10-A = 1 – 2.3 A pour les solution diluées et en écrivant l’absorbance A en fonction de la concentration (Loi de beer-lambert), on arrive à l’expression de l’intensité de la fluorescence :

If = 2.3 ΦfI0εl

La fluorescence des solutions diluée est donc bien proportionnelle à la concentration de la solution. On utilise généralement une expression simplifiée :
If = K.I0.c avec K une constante
Cette relation est valable uniquement pour les solutions diluées
Par ailleurs des phénomènes de « quenching » (extinction) peuvent se produire en présence d’autres composés à des concentrations importantes. En effet les collisions entre molécules entraîne des pertes d’énergie non radiatives et donc une baisse de la fluorescence.

L’intensité lumineuse émise décroît en l’absence  de source lumineuse selon :
I = Ioe[-kT]

Emission parasite en fluorimétrie 

Des émissions radiatives parasites dues au solvant peuvent gêner la lecture de la fluorescence si les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission sont proches :
La diffusion Rayleigh  : le solvant réémet une  partie de l’intensité incidente à la même longueur d’onde
La diffusion Raman : il y a excitation des molécules du solvant  (énergie de vibration). Le retour à l’état fondamental s’effectue avec émission de photons à de plus grande longueur d’onde. Elle est beaucoup plus faible que la diffusion Rayleigh. 

Matériel : le fluorimètre

Le fluorimètre permet de mesurer l'intensité de la fluorescence d'une molécule
La fluorescence est généralement mesurée à 90° pour ne pas avoir le faisceau incident dans l’axe de la mesure.

L’instrumentation d'un fluorimètre est classique et comporte 5 parties :
Source lumineuse : généralement une lampe à arc xénon
Monochromateur ou filtre
Compartiment à échantillon
Monochromateur ou filtre
Détecteur : photomultiplicateur ou photodiode